Smad同源物3(Smad3)人試劑盒ml062487
簡介
Smad同源物3也被稱為SMAD家族成員3或SMAD3，是一種由SMAD3基因編碼的蛋白質(zhì)。SMAD3是SMAD家族蛋白的一個成員。它是由轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族細胞因子發(fā)起的信號的介體，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和死亡。SMAD3基因位于15號染色體上的15q22.33的細胞帶。該基因由9個外顯子組成，超過129,339個堿基對。SMAD3是一個多肽，分子量為48,080 Da，它屬于SMAD家族的蛋白質(zhì)。它被SARA（用于受體激活的SMAD錨）招募到膜上，TGF-β受體位于那里。TGF-β的受體（包括結(jié)節(jié)、激活素、肌肽和其他家族成員）是膜激酶，優(yōu)先磷酸化和激活SMAD2和SMAD3。

本試劑盒人Smad3免疫測定是一種三步法固相夾心ELISA，用于測量細胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的人Smad3。試劑盒包含大腸桿菌表達重組人Smad3和針對重組蛋白產(chǎn)生的抗體。使用天然人Smad3獲得的結(jié)果顯示出與使用重組標準品獲得的標準曲線平行的線性曲線。這些結(jié)果表明，該試劑盒可用于測定天然人Smad3的相對質(zhì)量值。

檢測原理

試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù)：將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物Smad3，孵育清洗后，再加入檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體"免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色液后，若樣本中有待測物則顯藍色，則加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中Smad3的濃度。

需要的其他材料

1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；

2. 移液器及槍頭；

3. 蒸餾水或去離子水；

4. 100-1000 mL刻度量筒；

5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；

6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；

7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。

注意事項

1. 本試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹慎操作。

2. 本試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。

4. 佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品，處理后洗手。

試劑準備

1. 使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。

2. 洗滌液/稀釋液配置：如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1: 20稀釋（例如：1mL濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）

Smad同源物3(Smad3)人試劑盒ml062487
標準品配置

試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從800ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至40ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的40ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將40ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為：40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)。

結(jié)果的計算

計算標準品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線（作圖時去掉空白組的值）或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。若樣品OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

示例數(shù)據(jù)

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標準曲線。

本圖所示標準曲線僅供示例，結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結(jié)果

靈敏度

經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.31ng/mL。

特異性

該試劑盒測定可識別天然和重組人Smad3。

其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。

實驗步驟匯總
1. 加標準品及樣品，37℃避光反應(yīng)1.5h，洗滌3次。

2. 加檢測抗體，37℃避光反應(yīng)1h，洗滌4次。

3. 加酶結(jié)合物，37℃避光反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。

4. 加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。

5. 加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。

人Smad同源物3ELISA試劑盒用于定量檢測細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中人的Smad3，使用本產(chǎn)品之前，必須完整閱讀本說明書，人ELISA試劑盒僅供科研使用，不能于其它診斷。